Low impact to fixed cell processing aiming transmission electron microscopy

In cell culture, cell structures suffer strong impact due to centrifugation during processing for electron microscope observation. In order to minimise this effect, a new protocol was successfully developed. Using conventional reagents and equipments, it took over one week, but cell compression was reduced to none or the lowest deformation possible.

Avaliação do efeito da expressão da proteína NS1 do vírus Dengue em células hepáticas humanas: análises ultraestruturais e proteômicas / Effect of the expression of the NS1 protein of dengue virus in human liver cells: ultrastructural and proteomic analysis

O vírus Dengue (DENV) codifica uma poliproteína que é clivada em três proteínas estruturais (capsídeo,envelope e membrana) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3,NS4A, NS4B e NS5). Durante a infecção viral, a NS1 é encontrada no interior de células hospedeiras, associada à membrana plasmática e também secretada para a circulação como um multímero solúvel. [...] Considerando que o fígado é normalmente afetado pela infecção por DENV, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da expressão isolada da proteína NS1 em células de hepatocarcinoma humano,HepG2. Anteriormente, foram construídos em nosso laboratório plasmídeos contendo ogene ns1: pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E (peptídeo sinal da proteína NS1) e NS1; pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção Nterminalda NS2A (ANC), importante para a associação da NS1 à membrana plasmática; e pcTPANS1, que contém a sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionada à sequência NS1. Neste trabalho, nós inicialmente padronizamos um protocolo de transfecção eficiente para aHepG2, utilizando o plasmídeo pcENS1. Avaliamos três métodos de transfecção distintos: com os lipossomos Lipofectamina e FuGENE 6, e a eletroporação no aparelho NucleofectorTM. A produção da NS1 recombinante foi detectada e quantificada por imunofluorescência e citometria de fluxo...

The dengue virus (DENV) encodes a polyprotein,which is cleaved in three structural proteins (capsid, envelope and membrane) and sevennon-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5). During virusinfection, the NS1 is found inside host cells, associated with cell plasma membrane andalso secreted into the circulation as a soluble multimer. [...] Considering that the liver is normally affected by DENV infection, thiswork aimed to study the effect of isolated expression of the NS1 protein in humanhepatocellular carcinoma cells, HepG2. Previously, plasmids containing the ns1 genesequence were constructed in our laboratory: pcENS1, which encodes the C-terminalend of E protein (signal peptide of NS1 protein) and the NS1; pcENS1ANC, similar topcENS1 with the addition of the N-terminal portion of NS2A (ANC), important for NS1association with the plasma membrane; and pcTPANS1, encoding the human tissueplasminogen activator signal sequence (t-PA) fused to the NS1 sequence. In this work,we initially standardized an efficient protocol of HepG2 transfection, using the plasmidpcENS1. We evaluated three different transfection methods: with the liposomesLipofectamine and FuGENE 6 and the electroporation in NucleofectorTM Device. Therecombinant NS1 production was detected and quantified by immunofluorescence andflow cytometry. We observed a reduced number of cells producing NS1 in transfectionswith Lipofectamine (3.9 percent), and FuGENE 6 (6.8 percent)...

Caracterização morfológica dos hemócitos do Aedes aegypti e do Aedes albopictus e a resposta imune dos hemócitos do Aedes aegypti após a infecção pelo Dengue virus

Os insetos possuem mecanismos imunes que fornecem proteção contra diversos microorganismos. Estas barreiras anatômicas e fisiológicas incluem as respostas de defesa celulares e humorais. A maior parte dos estudos de imunidade de insetos concentra-se na resposta humoral. Entretanto, os hemócitos são também conhecidos por estarem envolvidos nas respostas imunes celulares contra muitos tipos de microorganismos. Inicialmente, nós caracterizamos os hemócitos dos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus revelando seis diferentes subpopulações celulares: prohemócito, adipohemócito, granulócito, plasmatócito, oenocitóide e trombocitóide. Nós demonstramos que estes mosquitos têm aproximadamente 3.000 hemócitos/μl de hemolinfa e eles exibem diversos padrões no reconhecimento de diferentes lectinas (Bandeiraea simplicifolia, Canavalis ensifonnis, Helix pomatia, Arachis hypogea, Ulex europaeus, Triticum vulgaris, Limulus polyphemus, Ricinus communis).

Os ensaios de endocitose demonstraram que, em A. albopictus, o granulócito e o plasmatócito apresentaram atividade fagocítica contra as partículas de látex. Além disso, nestas células e no oenocitóide foi observada a presença de diversos lisossomos através da utilização de anticorpos específicos. Em A. aegypti, o prohemócito, o granulócito e o oenocitóide foram os tipos celulares que endocitaram a albumina. Entretanto, o plasmatócito e o oenocitóide foram as células marcadas como possuindo lisossomos. Os estudos de interação do A. aegypti com Dengue virus demonstraram que no 5º e 7º dia após a alimentação oral houve um aumento significante no número total de hemócitos onde os plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos foram os tipos celulares que aumentaram neste período. Os estudos por microscopia exibiram alterações morfológicas características nos plasmatócitos e nos oenocitóides de A. aegypti devido à presença do vírus na hemolinfa. Entretanto, os plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos estão hábeis para endocitar os vírus, como demonstrado pela imonumarcação específica visualizada na microscopia confocal.

Caracterização morfológica dos hemócitos do Aedes aegypti e do Aedes albopictus e a resposta imune dos hemócitos do Aedes aegypti após a infecção pelo Dengue virus / Morphological characterization of the hemocytes of Aedes aegypti and Aedes albopictus and immune response of Aedes aegypti hemocytes after infection by Dengue virus

Os insetos possuem mecanismos imunes que fornecem proteção contra diversos microorganismos. Estas barreiras anatômicas e fisiológicas incluem as respostas de defesa celulares e humorais. A maior parte dos estudos de imunidade de insetos concentra-se na resposta humoral. Entretanto, os hemócitos são também conhecidos por estarem envolvidos nas respostas imunes celulares contra muitos tipos de microorganismos. Inicialmente, nós caracterizamos os hemócitos dos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus revelando seis diferentes subpopulações celulares: prohemócito, adipohemócito, granulócito, plasmatócito, oenocitóide e trombocitóide. Nós demonstramos que estes mosquitos têm aproximadamente 3.000 hemócitos/μl de hemolinfa e eles exibem diversos padrões no reconhecimento de diferentes lectinas (Bandeiraea simplicifolia, Canavalis ensifonnis, Helix pomatia, Arachis hypogea, Ulex europaeus, Triticum vulgaris, Limulus polyphemus, Ricinus communis).

Os ensaios de endocitose demonstraram que, em A. albopictus, o granulócito e o plasmatócito apresentaram atividade fagocítica contra as partículas de látex. Além disso, nestas células e no oenocitóide foi observada a presença de diversos lisossomos através da utilização de anticorpos específicos. Em A. aegypti, o prohemócito, o granulócito e o oenocitóide foram os tipos celulares que endocitaram a albumina. Entretanto, o plasmatócito e o oenocitóide foram as células marcadas como possuindo lisossomos. Os estudos de interação do A. aegypti com Dengue virus demonstraram que no 5º e 7º dia após a alimentação oral houve um aumento significante no número total de hemócitos onde os plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos foram os tipos celulares que aumentaram neste período. Os estudos por microscopia exibiram alterações morfológicas características nos plasmatócitos e nos oenocitóides de A. aegypti devido à presença do vírus na hemolinfa. Entretanto, os plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos estão hábeis para endocitar os vírus, como demonstrado pela imonumarcação específica visualizada na microscopia confocal.

Histopathological and ultrastructural aspects of mice lungs experimentally infected with dengue virus serotype 2

Histological and ultrastructural alterations in lung tissue of BALB/c mice infected with dengue virus serotype 2 (non-neuroadapted), by intraperitoneal and intravenous routes were analyzed. Lung tissues were processed following the standard techniques for photonic and electron transmission microscopies. Histopathological and ultrastructural studies showed interstitial pneumonia, characterized by the presence of mononuclear cells. In the mouse model, the dengue virus serotype 2 seems to led to a transient inflammatory process without extensive damage to the interalveolar septa, but caused focal alterations of the blood-exchange barrier. Endothelial cells of blood capillaries exhibited phyllopodia suggesting activation by presence of dengue virus. Morphometrical analysis of mast cells showed an expressive increase of the number of these cells in peribronchiolar spaces and adjacent areas to the interalveolar septa. Alveolar macrophages showed particles dengue virus-like inside rough endoplasmic reticulum and Golgi complex, suggesting viral replication. The tissue alterations observed in our experimental model were similar to the observed in human cases of dengue fever and dengue hemorrhagic fever. Our results show that BALB/c mice are permissive host for dengue virus serotype 2 replication and therefore provides an useful model to study of morphological aspects of dengue virus infection.

Morphological studies in a model for dengue-2 virus infection in mice

One of the main difficulties in studying dengue virus infection in humans and in developing a vaccine is the absence of a suitable animal model which develops the full spectrum of dengue fever, dengue haemorrhagic fever, and dengue shock syndrome. It is our proposal to present morphological aspects of an animal model which shows many similarities with the dengue infection in humans. BALB/c mice were intraperitoneally infected with non-neuroadapted dengue virus serotype 2 (DENV-2). Histopathological and morphometrical analyses of liver tissue revealed focal alterations along the infection, reaching wide-ranging portal and centrolobular veins congestion and sinusoidal cell death. Additional ultrastructural observations demonstrated multifocal endothelial injury, platelet recruitment, and alterated hepatocytes. Dengue virus antigen was detected in hepatocytes and in the capillar endothelium of the central lobular vein area. Liver function tests showed high levels of aspartate transaminase and alanine transaminase enzyme activity. Lung tissue showed interstitial pneumonia and mononuclear cells, interseptal oedema, hyperplasia, and hypertrophy of the bronchiolar epithelial cells. DENV-2 led to a transient inflammatory process, but caused focal alterations of the blood-exchange barrier. Viremia was observed from 2nd to 11th day p.i. by isolation of DENV-2 in C6/36 mosquito cell line inoculated with the supernatant of macerated liver, lung, kidney, and cerebellum tissues of the infected mice.

Pathologic study of a fatal case of dengue-3 virus infection in Rio de Janeiro, Brazil

Dengue hemorrhagic fever (DHF) is a severe febrile disease, characterized by abnormalities in hemostasis and increased vascular permeability, which in some cases results in hypovolemic shock syndrome and in dengue shock syndrome. The clinical features of DHF include plasma leakage, bleeding tendency and liver involvement. We studied the histopathological features of a fatal case of dengue-3 virus infection. The patient, a 63-year old male, presented with an acute onset of severe headache, myalgia and maculopapular rash. Tissue fragments (liver, spleen, lung, heart, kidney and lymph nodes) were collected for light microscopy studies and stained by standard methods. Histopathology revealed severe tissue damage, caused by intense hemorrhage, interstitial edema and inflammation. Some tissue sections were also processed with the immunoperoxidase reaction, which revealed the dengue viral antigen. Dengue-3 virus was isolated and identified with electron microscopy in a C6/36 cell culture inoculated with the patient's serum. Viral particles were detected in the infected cell culture.

Simultaneous infection with dengue 1 and 2 in a brazilian patient

Epidemias de dengue vem ocorrendo em varios estados brasileiros desde 1986 envolvendo os sorotipos 1 (DEN-1) e 2 (DEN-2). Em vista dos poucos casos de dupla infeccao documentados na literatura, relatamos aqui um caso de infeccao simultanea com DEN-1 e DEN-2 em uma paciente residente no municipio de Miranda, Estado de Mato Grosso do Sul, Regiao Centro-Oeste do Brasil. O DEN-1 foi introduzido nesse Estado em 1989 e o DEN-2 em 1996, com a circulacao de ambos em alguns municipios. Esta dupla infeccao foi identificada por isolamento de virus e imunofluorescencia indireta usando anticorpos monoclonais e confirmada pela reacao em cadeia da polimerase (PCR). Este e o primeiro caso de infeccao simultanea com os sorotipos 1 e 2 documentados no Brasil

Ultrastructural aspects of virus replication in one fatal case and several other isolates from a dengue type 2 outbreak in Rio de Janeiro

Dengue virus replication in mosquito cell cultures was observed by electron microscopy in one fatal and 40 classical isolates from a dengue type 2 outbreak in Rio de Janeiro and compared with the prototype New Guinea C strain. All the Brazilian isolates presented, beside the classical structured dengue virus particles, fuzzy coated virus-like particles, never observed in thereferencial New Guinea C virus strain. more numerous DEN-2 virus particles, fuzzy coated virus-like particles, defective virus particles and smooth membrane structures inside the rough endoplasmic reticulum characterized the unique fatal isolate examined

Replication of dengue viruses in mosquito cell cultures: a model from ultrastructural observations

Mosquito cell cultures infected with human sera from dengue-1 and dengue-2 outbreaks, started in Rio de Janeiro by 1986 and 1990 respectively, were examined by electron microscopy at different times post the infection of cell cultures. More information was obtained about cell penetration of virus particles in the presence or not of antibodies, their pathway inside the cells, replication mode and exit. Infectiveness of the virus at those different stages can only be attributed to the particles appearing inside the trans-Golgi vesicles; most of all newly formed virus particles remain inside the RER-derived cell vesicles or inside lysosomes, even during cell lysis. Groups of larges particles, 65-75 nm in diameter at dengue-2 infections, persist during cell passage. The large amounts of smooth membrane structures, as vesicles or tabules inside the RER are attributed to a cell response to viral infection